免疫組化(IHC)是一種利用抗體檢測(cè)組織切片中蛋白質(zhì)和其他抗原的技術(shù)，通過(guò)定位、定性和相對(duì)定量來(lái)研究這些抗原。以下是恒遠(yuǎn)生物為大家總結(jié)的免疫組化實(shí)驗(yàn)的完整攻略。
一、實(shí)驗(yàn)原理
免疫組化基于抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理。組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原先與一抗結(jié)合，然后通過(guò)二抗與一抗結(jié)合，最后通過(guò)顯色系統(tǒng)(如DAB)或熒光系統(tǒng)使目標(biāo)抗原可視化。
二、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
材料準(zhǔn)備：組織切片、抗體、緩沖液等
設(shè)備檢查：確保切片機(jī)、孵育箱等設(shè)備正常工作
工作臺(tái)清潔：確保無(wú)細(xì)菌和異物污染
實(shí)驗(yàn)計(jì)劃：制定標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，合理安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間
三、詳細(xì)操作步驟
1. 樣本處理
組織采集：手術(shù)或活檢獲取組織后，立即用10%中性福爾馬林固定(6-48小時(shí))
脫水包埋：組織經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后石蠟包埋
切片制備：使用切片機(jī)制作4-5微米厚的切片，60°C烤片30-60分鐘
2. 脫蠟水化
二甲苯溶液(Ⅰ)浸泡10分鐘
二甲苯溶液(Ⅱ)浸泡10分鐘
梯度酒精(100%、95%、80%、70%)各浸泡5分鐘
蒸餾水沖洗
3. 抗原修復(fù)
熱修復(fù)：常用pH6.0檸檬酸鹽緩沖液或pH9.0 Tris/EDTA緩沖液，95-100°C加熱20分鐘
酶修復(fù)：使用胰蛋白酶或蛋白酶K處理
冷凍切片可省去或減少抗原修復(fù)步驟
4. 阻斷內(nèi)源性物質(zhì)
3%過(guò)氧化氫溶液處理10分鐘，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶
正常血清(與二抗同源)封閉20分鐘，減少非特異性結(jié)合
5. 一抗孵育
選擇特異性高、親和力強(qiáng)的一抗
用PBS或TBS稀釋一抗(常用比例1:100-1:500)
滴加一抗覆蓋組織，4°C過(guò)夜或室溫1-2小時(shí)
PBS洗滌3次，每次5分鐘
6. 二抗孵育
選擇與一抗種屬匹配的二抗
室溫孵育30-60分鐘
PBS洗滌3次，每次5分鐘
7. 顯色反應(yīng)
DAB顯色：顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間(通常1-10分鐘)
熒光顯色：避光操作，選擇合適的熒光二抗
8. 復(fù)染與封片
蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1-2分鐘
梯度酒精脫水，二甲苯透明
中性樹(shù)脂封片或使用封片機(jī)
四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
樣本質(zhì)量：確保組織新鮮，固定及時(shí)充分
抗體選擇：驗(yàn)證抗體特異性，優(yōu)化稀釋比例
抗原修復(fù)：根據(jù)抗原特性選擇合適方法(pH值、時(shí)間)
對(duì)照設(shè)置：必須設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照
實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化：保持操作條件一致，避免批次差異
試劑保存：抗體分裝保存于-20°C，避免反復(fù)凍融
五、常見(jiàn)問(wèn)題解決
背景染色高：增加封閉時(shí)間，優(yōu)化抗體濃度，延長(zhǎng)洗滌時(shí)間
無(wú)信號(hào)：檢查抗原修復(fù)方法，驗(yàn)證抗體有效性，延長(zhǎng)孵育時(shí)間
非特異性染色：更換封閉血清，調(diào)整一抗特異性
組織脫落：使用防脫片玻片，優(yōu)化烤片時(shí)間和溫度
通過(guò)嚴(yán)格遵循上述流程和注意事項(xiàng)，可以獲得準(zhǔn)確可靠的免疫組化結(jié)果。對(duì)于初學(xué)者，建議從標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒開(kāi)始，逐步掌握各項(xiàng)技術(shù)細(xì)節(jié)。上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司擁有自己的實(shí)驗(yàn)室，備有專業(yè)的技術(shù)研發(fā)團(tuán)隊(duì)，長(zhǎng)期致力于各種生物試劑，細(xì)胞，血清，ELISA試劑盒的研發(fā)與銷售，實(shí)驗(yàn)提供免費(fèi)代測(cè)服務(wù)，并提供專業(yè)的技術(shù)服務(wù)，如果您有實(shí)驗(yàn)上的問(wèn)題歡迎前來(lái)咨詢，為您提供專業(yè)的一對(duì)一技術(shù)指導(dǎo)。
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